实验一：叶绿体色素含量的测定
目的
掌握叶绿体色素含量测定的基本原理和方法。
原理
叶绿体色素（包括叶绿素及类胡萝卜素）不易溶于水而易溶于有机溶剂，故可用丙酮、乙醇等有机溶剂提取。根据朗伯-比尔定律，某有色溶液的光密度D与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即：D= kCL。式中：k为比例常数。当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为 1 cm时，k为该物质的比吸收系数。各种有色物质溶液在不同波长下的比吸收系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的光密度而求得。如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总光密度等于各组分在相应波长下光密度的总和，这就是光密度的加和性。
测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波长下的光密度D，并根据叶绿素a、b及类胡萝卜素在该波长下的比吸收系数即可求出其浓度。叶绿素在640~660 nm的红光区和430~450 nm的蓝紫光区均有最大吸收峰，而类胡萝卜素及其他一些具有卟啉环结构的化合物在400~500 nm有最大吸收峰。测定叶绿素时，为了排除类胡萝卜素等物质的干扰，所用单色光的波长选择其在红光区的最大吸收峰。
已知叶绿素a、b的80%丙酮提取液在红光区的最大吸收峰分别为663 nm、645 nm，又知在波长663 nm下，叶绿素a、b在该溶液中的比吸收系数分别为82.4和9.27，在波长645 nm下分别为16.75和45.60，可根据加和性原则列出以下关系式：
D663 = 82.04Ca+ 9.27Cb
D645 = 16.75Ca + 45.60Cb
式中：D663、D645分别为叶绿素溶液在波长663 nm和 645 nm时的吸光度；
Ca、Cb分别为叶绿素a和叶绿素b的浓度（mg/L）。
解方程组得：
Ca = 12.72D663 – 2.59D645
Cb = 22.88D645 – 4.67D663
将Ca与Cb相加即得叶绿素总量CT：
CT = Ca + Cb= 20.29D645 + 8.05D663
另外，由于叶绿素a、b在652 nm的吸收峰相交，两者有相同的比吸收系数（均为34.5），也可以在此波长下测定一次吸光度（D652）而求出叶绿素a、b总量：
CT =（D652 × 1000）/34.5
在有叶绿素存在的条件下，用分光光度法也可以同时测定出溶液中类胡萝卜素的含量。 Lichtenthaler 等对 Arnon 法进行了修正，提出了80％丙酮提取液中3种色素含量的计算公式：
Ca = 12.21D663 – 2.81D645
Cb= 20.13D645 – 5.03D663
Cx =（1000D470 – 3.27Ca –104Cb）/229
式中：Ca、Cb为叶绿素a和b的浓度（mg/L）；Cx为类胡萝卜素的总浓度（mg/L）；D663、D645和D470为叶绿体色素提取液在波长663 nm、645 nm 和470 nm 下的吸光度。
由于叶绿体色素在不同溶剂中的吸收光谱有差异，因此，在使用其他溶剂提取色素时，计算公式也有所不同。叶绿素a、b在95％乙醇中最大吸收峰的波长分别为665 nm 和649 nm，类胡萝卜素为470 nm ，可据此列出以下关系式：
Ca = 13.95D665 – 6.88D649
Cb= 24.96D649 – 7.32D665
Cx=（1000D470 – 2.05Ca – 114.8Cb）/245
实验用品
实验材料
新鲜植物叶片（或其他绿色组织）。
试剂
95％乙醇（或80％丙酮）；石英砂；碳酸钙粉。
仪器设备
分光光度计，研钵，剪刀，棕色容量瓶，漏斗，滤纸，吸水纸，天平，离心机等。
实验步骤
取新鲜植物叶片，擦净组织表面污物，剪碎，混匀。
称取剪碎的新鲜样品0.5g，放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及2～3mL80％丙酮(或95％乙醇)，研成匀浆，再加80％丙酮(或95％乙醇)5mL，继续研磨至组织变白。
转移到25mL棕色容量瓶中，用少量80％丙酮(或95％乙醇)冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入容量瓶中。最后用80％丙酮(或95％乙醇)定容至25mL，摇匀。离心或过滤。
将上述色素提取液倒入光径1 cm的比色杯内。以80％丙酮(或95％乙醇)为空白，在波长663 nm（665 nm）、645 nm（649 nm）和470 nm下测定光密度。
结果计算
用95%乙醇提取代入下列公式：
Ca = 13.95D665 – 6.88D649
Cb= 24.96D649 – 7.32D665
Cx=（1000D470 – 2.05Ca – 114.8Cb）/245
用80%丙酮提取代入下列公式：
Ca = 12.21D663 – 2.81D645
Cb= 20.13D645 – 5.03D663
Cx =（1000D470 – 3.27Ca – 104Cb）/229
将吸光值代入公式，分别计算叶绿素a、b和类胡萝卜素的浓度（mg/L）。叶绿素a、b浓度相加即为叶绿素总浓度（mg/L）。
将色素浓度代入下列公式，计算单位鲜重组织中各种色素的含量：
叶绿体色素含量（mg/L）= C·V·N·W-1
式中：C——色素浓度（mg/L）；V——提取液体积（mL）；W——植物组织鲜重（g）；N——稀释倍数。
注意事项
为了避免叶绿素的光分解，操作时应在弱光下进行，研磨时间应尽量短些。
叶绿体色素提取液不能浑浊。可在710或 750 nm 波长下测量消光度，其值应小于当波长为叶绿素a吸收峰时消光度值的5％，否则应重新过滤。
用分光光度计法测定叶绿素含量，对分光光度计的波长精确度要求较高。如果波长与原吸收峰波长相差l nm，则叶绿素a的测定误差为2％，叶绿素b为19％，使用前必须对分光光度计的波长进行校正。校正方法除按仪器说明书外，还应以纯的叶绿素a和b来校正。
如用离心法提取色素，一定要注意离心管要配平。
实验二：植物组织水势的测定（小液流法）
目的
掌握小液流法测定植物组织水势的原理和方法。
原理
水势表示水分的化学势，像电流之由高电位处流向低电位处一样，水从水势高处流向低处。植物体细胞之间，组织之间以及植物体和环境间的水分移动方向都由水势差决定。
当植物细胞或组织放在外界溶液中时，如果植物的水势小于溶液的渗透势（溶质势），则组织吸水而使溶液浓度变大；反之，则植物细胞内水分外流而使溶液浓度变小；若植物组织的水势与溶液的渗透势相等，则二者水分保持动态平衡，所以外部溶液浓度不变，而溶液的渗透势即等于所测植物的水势。可以利用溶液的浓度不同其比重也不同的原理来测定试验前后溶液的浓度的变化，然后根据公式计算渗透势。
实验用品
实验材料
植物叶片或马铃薯块茎。
试剂
1 mol·L-1蔗糖溶液；甲烯蓝粉末
器具
吸水纸、容量管(或 10mL 量筒)、试管、带盖青霉素小瓶、胶头细玻璃弯管、移液管、剪刀或打孔器、橡皮塞和软木塞、试管架、温度计和镊子。
实验步骤
取6支5mL带塞试管编号，排列于试管架上，另取6支10m1的带塞试管编上相同的号码，与5mL试管对应排列于试管架上。所用试管一定要干燥。
取1mol/L蔗糖溶液作母液，用蒸馏水将其稀释成下列各浓度：0.1、0.2，0.3、0.4、0.5、0.6mol/L，各10m1。然后充分摇匀，加塞。
用移液管从10m1试管中，取出不同浓度的蔗糖溶液1m1，分别装人相对应的5m1试管中，立即加塞。移液管与浓度一一对应。
取生长状态一致的植物叶片数片（擦干表面水分），在叶片的相同部位（应避免叶脉）用打孔器打取小圆片，用镊子向5m1试管中各投入10片，使溶液浸没小圆片，加塞放置约30分钟，其间经常摇动小试管，并保持小圆片浸没于溶液中。打取小圆片及投入试管中时，动作应尽量快速。
到时间后，向5m1试管中各加人甲烯蓝粉末少许（以染成蓝色为度），摇匀，使溶液着色。
取干燥毛细管6支，分别从5mL试管中吸取蓝色溶液（约为毛细管的一半以上），用吸水纸将毛细管外壁的蓝色溶液擦干净，然后插入与5mL试管相对应的10m1试管中，使毛细管内的液面高于试管内的液面约1-2cm，然后缓慢放出蓝色溶液一小滴，保持毛细管静止不动（可将毛细管壁靠在试管口上），观察蓝色小液滴的移动方向,然后缓慢取出毛细管插回5mL试管中。插入和取出毛细管时动作应缓慢并保持毛细管内溶液不漏出。毛细管与浓度应一一对应。
将蓝色小液滴移动方向填入下表中，若小液滴向上移动，则说明叶片组织水势大于该浓度蔗糖溶液的水势；若向下移动则相反；若静止不动，则说明叶片组织的水势与该蔗糖溶液的水势相等；如果在前一浓度中向下移动，而在后一浓度中向上移动，则植物组织的水势可取二种浓度蔗糖溶液水势的平均值。
表1 小液流法现象观察记录表
蔗糖浓度（mol/L） | 0.1 | 0.2 | 0.3 | 0.4 | 0.5 | 0.6 |
小液滴移动方向 |
记录实验时的温度（℃）
植物组织水势值计算
将测得的等渗浓度值代入以下公式计算出植物组织的水势：
ψW=ψл=i·C·R·T（MPa）
公式中：ψW —植物组织水势,单位：Mpa（兆帕）
ψл —溶液的渗透势（即溶液的水势）
C—等渗浓度（mol·L
1）
R—气体常数（0.0083 L·MPa·mol
1·K
1）
T—热力学温度单位K, 即273 + t, t 为实验温度, 单位是℃。
i—解离系数（蔗糖 =1；CaCl2 =2.60）
注意事项
配制糖液浓度要准确，并充分摇匀。
取样时选材要一致。
打孔时要避开大叶脉。
加甲烯蓝要适量，过多会影响溶液浓度，过少则很难识别小液流移动方向。