实验一 蚕豆根尖细胞微核实验
一、实验目的
通过本实验掌握植物根尖细胞核染色技术，以及利用微核率监测环境污染状况和简单的统计方法。
二、实验原理
微核(micronucleus，MN)是无着丝点的染色体断片，在有丝分裂后期不能向两极移动，所以游离于细胞质中，在间期细胞核形成时，即可在它附近看到一到几个很小的圆形结构，直径大约是细胞直径的1/20-1/5。微核是常用的遗传毒理学指标之一，指示染色体或纺锤体的损伤。由于这种损伤会因细胞受到的外界诱变因子的作用而加剧，而微核产生的数量又与诱变因子剂量的强弱呈正比，因此可以用微核出现的频率来评价环境诱变因子对生物遗传物质的损伤程度。
蚕豆(Vicia faba)染色体数少(2 n=12)，其根尖细胞的染色体大，DNA含量多，对诱变物反应敏感，常常被作为细胞遗传学分析染色体畸变的实验材料。本实验选用蚕豆初生根尖细胞作为研究对象，观察其微核在受到环境致突变物作用后的变化情况。蚕豆根尖细胞微核测试技术简便、易行、费用低，适用于河流湖泊、水库、池塘以及各种工矿企业废水、生活污水中所含致突变物的监测，在1986年已被国家环保局列为一种环境生物测试的规范方法，在我国不少地区的环保部门和医疗卫生系统中都有广泛的应用。
三、实验材料、器材和试剂
蚕豆(Vicia faba)
品种“松滋青皮”，该品种是专门筛选出来用来进行致突变性微核测试的，具有灵敏度高，本底微核率低的优点。
器材
显微镜、计数器、恒温箱、脱脂棉、瓷盘、培养皿、青霉素空瓶、载玻片、盖玻片、解剖针(、冰箱)
3、试剂
卡诺氏固定液：无水乙醇(或95%乙醇)3份加冰醋酸1份。固定根尖时随用随配。
席夫(Schiff)试剂：称0.5g碱性品红加蒸馏水100ml于三角烧瓶中煮沸5min，并不断搅拌溶解。冷却至60C左右过滤到深棕色试剂瓶种，待滤液冷却到25C时再加入10ml 1N HCl和1g 偏重亚硫酸钠或偏重亚硫酸钾，充分振荡溶解。塞紧瓶口，用黑纸包好，置于暗处至少24小时，检查染色液如果无色透明即可使用。此染色液在4C冰箱中可保存6个左右，如出现沉淀就不能再用。
SO2洗涤液：贮存液(10%Na2S2O5或10%K2S2O5，1N HCl)。使用时，5ml贮存液加5 ml 1N HCl，再加100 ml蒸馏水，现用现配。
500ppm Cd(NO3)2
5N HCl
四、实验步骤
1、蚕豆浸种催芽
取蚕豆(品种)100颗放入盛有蒸馏水的烧杯中，在25°C的恒温箱内浸泡约27h，期间换水2次；待种子吸胀后，换用纱布包裹置于解剖盘中，在25°C恒温箱中继续催芽约12小时，注意保持湿度。待种子初生根露出2-3mm时，选取发芽良好的种子，放入铺满薄层脱脂棉的解剖盘内，相同条件下继续催芽。经46小时后，种子大部分初生根长至2-3cm，根毛发育良好，可以用来染毒。
2、蚕豆根尖染毒
选取初生根尖生长良好、根长一致的种子，放入盛有预配染毒液(Cd2+)的培养皿中，水样浸泡住根尖即可。培养皿做好标记。用蒸馏水处理作为空白对照，方法相同。染毒5个小时左右。
3、根尖细胞恢复培养
(1)将经过染毒的种子，用蒸馏水浸洗3次，每次2-3min；
(2)洗净后的种子再放入铺好湿脱脂棉的培养皿中，培养皿要做好标记。按照前述培养条件使根尖细胞恢复24h。
4、固定根尖细胞
将恢复后的种子，从根尖顶端切下1cm长的幼根放入青霉素空瓶中(青霉素瓶预先经过消毒，以免对实验结果产生影响)，加入卡诺氏固定液固定24h。
5、孚尔根(Feulgen)染色
(1)固定好的幼根，在青霉素瓶中用蒸馏水浸洗2次，每次5min；
(2)吸净蒸馏水，再加入5N盐酸将幼根泡住，连瓶放入28°C恒温箱中水解幼根25min左右，至幼根被软化即可。
(3)用蒸馏水浸洗幼根2次，每次5min。
(4)在暗室条件下，加席夫(Schiff)试剂，每瓶用量淹住幼根液面高出2mm。染色5h左右。
(5)除去染液，用SO2洗涤液浸洗幼根2次，每次5min。
(6)用蒸馏水浸洗一次，5min。
(7)将幼根放入新换的蒸馏水中，置于4°C冰箱内保存，可供随时制片。
6、制片
(1)将幼根放在擦净的载玻片上，用解剖针截下1mm左右的根尖。
(2)滴上2-3滴蒸馏水，用解剖针将根尖捣碎。
(3)加盖一个清洁的盖玻片，注意不要有气泡，否则影响观察效果。
(4)在盖玻片上再加一块滤纸，轻轻敲打压片，使细胞均匀分散成近似于圆形的一个薄层，以便于观察微核。
五、实验结果及分析
1、镜检方法及微核识别
将制片先置于显微镜低倍镜下，找到细胞制片的中央，然后换用高倍镜(物镜160)分别在这个近圆形的细胞制片的正上、正下、正左、正右、左上、左下、右上、右下八个方位各观察一个视野，最好找细胞分散较为均匀的视野进行观察计数以达到最好的观察效果，最大可能地避免实验者计数的主观性。选择8个视野是为了保证细胞观察的随机性，使实验结果更为合理和具有代表性。2、数据分析
观察染毒处理后的3个根尖，每个根尖计数细胞2000个左右，纪录观察细胞总数、观察到的微核总数，然后计算微核千分率(MN%)。再选取空白对照三个，对两组数据进行差异显著性检验(如：t-检验)。
思考
重金属Cd对蚕豆根尖细胞微核率有何影响，主要原因如何？哪些因素可能影响利用微核率监测污染的效果。
参考文献
金波、陈光荣 1998 遗传毒理与环境检测 武汉：华中师范大学出版社
实验二 CTAB法提取植物总DNA
实验目的
从植物组织中分离提取遗传物质DNA，是基因组分析和DNA遗传标记分析的第一步。DNA提取质量的好坏将直接影响到后续的遗传分析。通过本实验，要求掌握提取植物总DNA的一般过程和方法，了解提取原理，掌握采用CTAB法从植物中提取总DNA的技术。
实验原理
植物基因组总DNA的提取过程主要包括：破细胞壁，破细胞膜，去除杂质(如蛋白质、多糖、RNA、丹宁等)，沉淀DNA等过程。常用方法主要有CTAB法和SDS法两种。CTAB和SDS都是有效的去污剂，主要起到破细胞膜的作用，同时还可在一定程度上保护DNA免受内源核酸酶的降解作用。
本实验提取过程是经过修改的CTAB法。
实验材料、仪器与试剂
实验材料：硅胶干燥的水杉(Metasequoia glyptostroboides)或其他植物叶片。
主要器材：研钵、 1.5ml微量离心管，微量加样枪、高速冷冻离心机、恒温水浴锅，Gel Doc2000™凝胶图像系统、水平电泳槽等。
主要试剂：
RnaseA
无水乙醇
70%乙醇
氯仿－异戊醇(24:1)
匀浆缓冲液：100 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0；1.4 mol/L NaCl；20 mmol/L EDTA，0.3% 2-巯基乙醇(V/V)；2% PVP(W/V)(聚乙烯吡咯烷酮 K-30)。2-巯基乙醇和PVP应在使用前加入。
2×CTAB提取缓冲液：100 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0；1.4 mol/L NaCl；20 mmol/L EDTA，pH 8.0；2% CTAB(W/V)；0.3% 2-巯基乙醇(V/V)；2% PVP(W/V)(聚乙烯吡咯烷酮 K-30)。2-巯基乙醇和PVP应在使用前加入。
1×TE缓冲液：1 mol/L Tris-HCl，pH 8.0；1 mmol/L EDTA
实验步骤
称取约0.05g硅胶干燥的水杉叶片，用研钵直接研磨，磨碎后加入1 ml的匀浆缓冲液，转入1.5ml 微量离心管中，在高速冷冻离心机上10,000rpm，4℃离心10min。
弃上清液，立即添加750 l预热至60℃的DNA提取缓冲液，用牙签充分搅拌均匀。60℃水浴60min。期间，每10分钟上下混匀一次。水浴结束后取出冷却至室温。
加入等体积(750 l)的氯仿－异戊醇(24:1)，上下颠倒离心管几次，直到形成乳浊液为止。在高速冷冻离心机上，以13,000 rpm，4℃离心10min。
用加样枪小心吸取600l上清液，转移到一标记好的新离心管中，加入等体积(600l)的氯仿－异戊醇，13,000 rpm，4℃离心10min。
用加样枪小心吸取400l上清液，加入2 l 10 mg/ml的RNaseA，37℃水浴30min。冷却至室温。
加入等体积(400l)的氯仿－异戊醇，使之形成乳浊液，13,000 rpm，4℃离心10min。
用加样枪小心吸取200l上清液，加入2倍体积预冷(-20℃)的无水乙醇，轻轻地混匀，此时应可以看到出现白色的絮状沉淀。如果没有明显可见的沉淀产生，将混合物置于-20℃冷冻30min。
13,000 rpm，4℃离心10min。将上清液从离心管中倒出，小心不要把DNA沉淀也一同倒了。
加入1 ml 预冷的70%乙醇以清洗DNA 沉淀，10,000 rpm，4℃条件离心5min。
弃上清液，将离心管倒置于铺有吸水纸的工作台上，自然风干，约需1-2hr。
加入25 l TE 缓冲液，以溶解DNA沉淀。这是DNA储存液，短时储存可放于4℃冰箱，-20℃可长时间储存。
结果检测
取5lDNA储存液，加溴酚兰点样，加样于0.8％的琼脂糖(agrose)凝胶样孔中，120v电泳。电泳结果在凝胶成像系统中观察。
参考文献
Doyle, J. J., and J. L. Doyle. 1987. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochemical Bulletin 19:11-15.